组蛋白去乙酰化酶抑制剂对创伤性脑损伤小鼠的神经保护作用及机制研究

【摘要】第一部分组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对创伤性脑损伤小鼠的神经保护作用创伤性脑损伤(traumaitcbraininjury,TBI)是神经外科领域常见的急症之一,目前己成为全世界35岁以下青壮年人群第一位死亡和致残原因。但是目前临床上尚无一种确切的药物对脑损伤肯定有效。最新研究发现,在TBI后组蛋白乙酰化水平显著降低,并且可能与继发性损伤如氧化应激和兴奋性毒性相关。使用某些组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂能明显改善TBI后运动功能,增强神经可塑性和学习记忆能力,减轻脑组织损伤,这提示HDAC抑制剂对于TBI可能是一种非常有潜力多效神经保护剂。Scriptaid是异羟肟酸类中较新型的HDAC抑制剂,副作用较小,安全系数较高,目前国内外还没有将Scriptaid运用于中枢神经系统损伤的报道。因此,十分有必要将Scriptaid对于TBI损伤后的神经保护作用作全面评估,同时对于其可能涉及细部、分子机制作深入研究。我们首先建立标准化的小鼠控制性皮层撞击模型(controlledcorticalimpact,CCI)实现可重复性的创伤性脑损伤,来模拟人类脑外伤情况。手术后0.5或12小时分别给予1.5、3.5、5.5mg/KgScriptaid腹腔注射。采用肌力测试、前肢不对称测试以及错步实验来评测小鼠短期和长期运动功能。TBI后29至34天利用水迷宫测试认知功能。焦油紫染色用来分析计算脑损伤体积和计算海马CA3区存活神经元数量。微管相关蛋白-2(MAP-2)组织化学染色结合Fluo-JadeB染色来分析创伤后神经元退行性变。同时为了探讨Scriptaid神经保护机制,我们利用免疫组化和Westernbolt方法来研究相关信号通路激活情况。研究结果显示,Scriptaid对于创伤性脑损伤小鼠具有明显的神经保护作用,且存在着剂量依赖关系(尤以3.5μg/g剂量疗效最佳),即使TBI后12小时给予治疗仍然有效；TBI后损伤周边区HDAC1、HDAC2、HDAC3具有不同程度增加,使用Scriptaid后能明显抑制HDAC活性,增强乙酰化H3、H4水平。Scriptaid治疗对于TBI后小鼠具有长期的神经保护作用,能明显改善神经功能评分,提高学习、记忆能力,减少海马CA3区神经元丢失,阻止神经元退行性变。免疫荧光和Westernblot结果显示p-AKT和p-PTEN于TBI后在损伤侧皮层和海马CA3区显著下降,而总AKT和PTEN水平并没有发生变化。使用Scriptaid治疗后能使p-PTNE水平增加,进而增强PTEN的稳定性而使其活性下降,从而减少对于AKT通路的负性调控作用。进一步研究发现,Scriptaid能通过增加PTEN磷酸化激酶ROCK1mRNA表达来调控PTEN的磷酸化。最后,使用AKT通路的抑制剂LY294002后,能逆转Scriptaid的神经保护作用,进一步反向证明Scriptaid通过激活PTEN/AKT通路来发挥神经保护作用。总之,本研究发现HDAC抑制剂Scriptaid能显著减轻TBI造成的急、慢性损害,改善神经功能,减少TBI后脑组织缺失,同时能明显减轻海马神经元变性坏死,增强学习记忆功能,其作用与激活PTEN/PI3K/AKT通路有关。本实验为临床运用Scriptadi治疗TBI,促进神经功能恢复,提供了重要的实验依据。第二部分抑制组蛋白去乙酰化酶可调控小胶质细胞极化动态并参与TBI白质损伤修复创伤性颅脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)不仅导致脑灰质损伤,同时可产生严重的白质损伤。研究发现在TBI病人白质损伤的程度与长期的运动和认知功能缺陷有相关性。因此,为何在临床前实验中,神经保护剂如果只是单一强调对灰质的保护,一旦过度到临床试验时通常都会失败。本研究发现新型HDAC抑制剂Scriptaid能增强组蛋白乙酰化,并对TBI具有强烈的神经保护作用,但是其对于TBI白质损伤的演变和预后依然未知,很值得再深入研究。首先通过标准化的控制性皮层撞击来建立可重复性的小鼠脑外伤模型。运用RT-PCR的方法测定脑组织内M1期和M2期不同的标记物分子mRNA水平时间依从性的表达情况；采用免疫荧光染色、共聚焦成像等方法观察TBI后皮层、纹状体、胼胝体等不同脑区小胶质细胞激活的时间依从性。髓鞘相关蛋白(MBP)和非磷酸化神经丝重链(SMI-32)免疫荧光双标技术来检测TBI白质损伤情况,并与小胶质细胞极化动态做相关性分析。使用HDAC抑制剂Scirptaid于TBI后6小时给予3.5mg/Kg腹腔注射,小鼠于不同时间点处死,最长观察直至术后35天。体外实验中,酶联免疫吸附实验来检测小胶质细胞炎性因子释放。采用条件性培养基交换系统来分析HDAC抑制对于小胶质细胞的极化作用以及不同亚型小胶质细胞对于损伤后少突胶质细胞的影响。结果发现,TBI后小胶质细胞会时间依从性的极化现象,即经历了短暂性M2型之后转化为更持久的M1型。同时TBI后存在时间依从性白质损伤,伴有M1小胶质细胞增加,M2型减少,而且前者与白质损伤程度呈现正相关；体外实验也表明,M1型小胶质细胞能加剧少突胶质细胞死亡,而M2型则能发挥保护作用。Scriptaid后能明显抑制小胶质细胞的炎症反应,并能调控小胶质细胞由M1型向M2型转变。重要的是,Scriptaid通过介导对于小胶质细胞亚型的调控作用来发挥对于TBI白质损伤的保护作用,具有维持白质的正常结构形态,保持髓鞘的完整性的功能。综述所述,机械性脑外伤可以诱导小胶质细胞／巨噬细胞的急、慢性的炎症反应。小胶质细胞由短暂的M2亚型很快被慢性的M1亚型所取代,且后者与白质损伤的严重程度相关。重要的是通过使用HDAC抑制剂增强组蛋白乙酰化的同时,能明显抑制小胶质细胞的炎症反应,并且能调控小胶质细胞由M1型向M2型转变,对于TBI白质损伤有明显的长期保护作用。HDAC抑制剂这种更加细化的作用,可以使得在TBI后强化有利的吞噬反应的,同时减少灰质和白质部位的继发性二次级联损伤。这也为TBI等神经系统损伤提供了新的治疗靶点,同时为神经保护药物的开发提供更多的理论依据和新的研究思路。
【作者】王国华；
【导师】陈俊；
【作者基本信息】复旦大学，神经生物学，2013，博士
【关键词】创伤性脑损伤；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；控制性皮层撞击模型；神经保护；AKT通路；第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因；白质损伤；表观遗传；神经炎症；小胶质细胞极化；少突胶质细胞；

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